El veneno de serpiente contiene enzimas que hidrolizan los enlaces de éster carboxilo.Los sustratos para la hidrólisis son fosfolípidos, acetilcolina y acetato aromático.Estas enzimas incluyen tres tipos: fosfolipasa, acetilcolinesterasa y esterasa aromática.La arginina esterasa en el veneno de serpiente también puede hidrolizar la arginina o la lisina sintéticas, pero hidroliza principalmente los enlaces peptídicos de proteínas en la naturaleza, por lo que pertenece a la proteasa.Las enzimas discutidas aquí solo actúan sobre sustratos de éster y no pueden actuar sobre ningún enlace peptídico.Entre estas enzimas, las funciones biológicas de la acetilcolinesterasa y la fosfolipasa son las más importantes y han sido completamente estudiadas.Algunos venenos de serpiente tienen una fuerte actividad de esterasa aromática, que puede hidrolizar el éster etílico de p-nitrofenilo, el acetato de a- o P-naftaleno y el éster etílico de indol.Todavía se desconoce si esta actividad es producida por una enzima independiente o un efecto secundario conocido de la carboxilesterasa, y mucho menos su significado biológico.Cuando el veneno de Agkistrodon halys Japonicus se hizo reaccionar con éster etílico de p-nitrofenilo y éster etílico de indol, no se encontraron los hidrolizados de p-nitrofenol e indolfenol;Por el contrario, si estos ésteres reaccionan con el veneno de serpiente de la subespecie cobra Zhoushan y el veneno de serpiente Bungarus multicinctus, se hidrolizarán rápidamente.Se sabe que estos venenos de cobra tienen una fuerte actividad de colinesterasa, que puede ser responsable de la hidrólisis de los sustratos anteriores.De hecho, Mclean et al.(1971) informaron que muchos venenos de serpientes pertenecientes a la familia Cobra pueden hidrolizar éster etílico de indol, éster etílico de naftalina y éster etílico de butilo.Estos venenos de serpiente provienen de: cobra, cobra de cuello negro, cobra de labios negros, cobra dorada, cobra egipcia, cobra real, mamba cobra dorada, mamba negra y mamba de labios blancos (D. aw todavía conoce la serpiente de cascabel rómbola oriental
El veneno de serpiente puede hidrolizar metil indol etil éster, que es el sustrato para determinar la actividad de colinesterasa en suero, pero este veneno de serpiente no muestra actividad de colinesterasa.Esto muestra que hay una esterasa desconocida en el veneno de cobra, que es diferente de la colinesterasa.Para comprender la naturaleza de esta enzima, se necesita más trabajo de separación.
1, Fosfolipasa A2
(I) Descripción general
La fosfolipasa es una enzima que puede hidrolizar el fosfato de glicerilo.Hay 5 tipos de fosfolipasa en la naturaleza, a saber, fosfolipasa A2 y fosfolipasa
A., fosfolipasa B, fosfolipasa C y fosfolipasa D. El veneno de serpiente contiene principalmente fosfolipasa A2 (PLA2), algunos venenos de serpiente contienen fosfolipasa B y otras fosfolipasas se encuentran principalmente en tejidos animales y bacterias.La figura 3-11-4 muestra el sitio de acción de estas fosfolipasas en la hidrólisis del sustrato.
Entre las fosfolipasas, la PLA2 se ha estudiado más.Puede ser la enzima más estudiada en el veneno de serpiente.Su sustrato es el enlace éster en la segunda posición de Sn-3-glicerofosfato.Esta enzima se encuentra ampliamente en el veneno de serpiente, veneno de abeja, veneno de escorpión y tejidos animales, y PLA2 es abundante en venenos de serpiente de cuatro familias.Debido a que esta enzima rompe los glóbulos rojos y causa hemólisis, también se le llama “hemolisina”.Algunas personas también la llaman lecitinasa hemolítica PLA2.
Ludeeke descubrió por primera vez que el veneno de serpiente puede producir un compuesto hemolítico al actuar sobre la lecitina a través de enzimas.Más tarde, Delezenne et al.demostró que cuando el veneno de cobra actúa sobre el suero o la yema de caballo, forma una sustancia hemolítica.Ahora se sabe que PLA2 puede actuar directamente sobre los fosfolípidos de la membrana de los eritrocitos, destruyendo la estructura de la membrana de los eritrocitos y provocando hemólisis directa;También puede actuar sobre el suero o la lecitina añadida para producir lecitina hemolítica, que actúa sobre los glóbulos rojos para producir hemólisis indirecta.Aunque PLA2 es abundante en las cuatro familias de venenos de serpiente, el contenido de enzimas en varios venenos de serpiente es ligeramente diferente.serpiente de cascabel
El veneno de serpiente solo mostró una actividad débil de PLA2.La Tabla 3-11-11 ilustra la comparación de la actividad PLA2 de 10 venenos principales de serpientes venenosas en China.
Cuadro 3-11-11 Comparación de las actividades de fosfolipasa VIII de 10 venenos de serpiente en China
Veneno de serpiente
liberación de grasa
ácido alifático,
Cjumol/mg)
Actividad hemolítica CHU50/^ g * ml)
Veneno de serpiente
Libera ácidos grasos
(^raol/mg)
Actividad hemolítica” (HU50/ftg * 1111)
Najanaja atra
9. 62
once
Micracefalo ofis
cinco punto uno cero
kalyspallas
8. 68
dos mil ochocientos
Gracilis
V, agudo
7. 56
* * #
ofiofago hannah
tres punto ocho dos
ciento cuarenta
Bnugarus fasctatus
7,56
doscientos ochenta
B. multicinctus
uno punto nueve seis
doscientos ochenta
víbora a russelli
siete punto cero tres
T, mucrosquamatus
uno punto ocho cinco
siamense
T. stejnegeri
0. 97
（2） Separación y purificación
El contenido de PLA2 en el veneno de serpiente es grande y es estable al calor, ácido, álcali y desnaturalizante, por lo que es fácil de purificar y separar PLA2.El método común es realizar primero una filtración en gel del veneno crudo, luego realizar una cromatografía de intercambio iónico y repetir el siguiente paso.Cabe señalar que la liofilización de PLA2 después de la cromatografía de intercambio iónico no debería causar agregación, porque el proceso de liofilización a menudo aumenta la fuerza iónica en el sistema, que es un factor importante que provoca la agregación de PLA2.Además de los métodos generales anteriores, también se han adoptado los siguientes métodos: ① Wells et al.② El sustrato análogo de PLA2 se utilizó como ligando para la cromatografía de afinidad.Este ligando puede unirse a PLA2 en veneno de serpiente con Ca2+.El EDTA se usa principalmente como eluyente.Después de eliminar el Ca2+, la afinidad entre PLA2 y el ligando disminuye y puede disociarse del ligando.Otros utilizan una solución orgánica al 30 % o urea a 6 mol/L como eluyente.③ Se realizó una cromatografía hidrófoba con PheiiylSephar0SeCL-4B para eliminar las trazas de PLA2 en la cardiotoxina.④ El anticuerpo anti PLA2 se usó como ligando para realizar la cromatografía de afinidad en PLA2.
Hasta el momento, se ha purificado una gran cantidad de PLAZ de veneno de serpiente.Tu et al.(1977) enumeró PLA2 purificada a partir de veneno de serpiente antes de 1975. En los últimos años, cada año se ha publicado una gran cantidad de artículos sobre la separación y purificación de PLA2.Aquí, nos enfocamos en la separación y purificación de PLA por académicos chinos.
Chen Yuancong et al.(1981) separaron tres especies de PLA2 del veneno de Agkistrodon halys Pallas en Zhejiang, que se pueden dividir en PLA2 ácidas, neutras y alcalinas según sus puntos isoeléctricos.Según su toxicidad, la PLA2 neutra es más tóxica, la cual ha sido identificada como neurotoxina presináptica Agkistrodotoxina.La PLA2 alcalina es menos tóxica y la PLA2 ácida casi no tiene toxicidad.Wu Xiangfu et al.(1984) compararon las características de tres PLA2, incluido el peso molecular, la composición de aminoácidos, el extremo N, el punto isoeléctrico, la estabilidad térmica, la actividad enzimática, la toxicidad y la actividad hemolítica.Los resultados mostraron que tenían un peso molecular y una estabilidad térmica similares, pero tenían diferencias significativas en otros aspectos.En el aspecto de la actividad enzimática, la actividad enzimática ácida fue mayor que la actividad enzimática alcalina;El efecto hemolítico de la enzima alcalina sobre los glóbulos rojos de rata fue el más fuerte, seguido de la enzima neutra y la enzima ácida apenas se hemolizó.Por lo tanto, se especula que el efecto hemolítico de PLAZ está relacionado con la carga de la molécula PLA2.Zhang Jingkang et al.(1981) han fabricado cristales de Agkistrodotoxina.Tu Guangliang et al.(1983) informó que un PLA tóxico con un punto isoeléctrico de 7,6 fue aislado y purificado del veneno de Vipera rotundus de Fujian, y sus propiedades físicas y químicas, composición de aminoácidos y la secuencia de 22 residuos de aminoácidos en el N -terminal fueron determinados.Li Yuesheng et al.(1985) aislaron y purificaron otra PLA2 del veneno de Viper rotundus en Fujian.La subunidad de la PLA2* es 13 800, el punto isoeléctrico es 10,4 y la actividad específica es 35/xnioI/miri mg。 Con lecitina como sustrato, el pH óptimo de la enzima es 8,0 y la temperatura óptima es 65 °C LD5 inyectado por vía intravenosa en ratones.Es 0,5 ± 0,12 mg/kg.Esta enzima tiene efectos anticoagulantes y hemolíticos obvios.La molécula tóxica PLA2 consta de 123 residuos de 18 tipos de aminoácidos.La molécula es rica en cisteína (14), ácido aspártico (14) y glicina (12), pero solo contiene una metionina y su N-terminal es un residuo de serina.En comparación con PLA2 aislado por Tuguang, el peso molecular y la cantidad de residuos de aminoácidos de las dos isoenzimas son muy similares, y la composición de aminoácidos también es muy similar, pero la cantidad de residuos de ácido aspártico y prolina es algo diferente.El veneno de la serpiente cobra real de Guangxi contiene PLA2 rico.Shu Yuyan et al.(1989) aislaron una PLA2 del veneno, que tiene una actividad específica 3,6 veces mayor que el veneno original, un peso molecular de 13000, una composición de 122 residuos de aminoácidos, un punto isoeléctrico de 8,9 y buena estabilidad térmica.A partir de la observación con microscopio electrónico del efecto de la PLA2 básica en los glóbulos rojos, se puede ver que tiene un efecto obvio en la membrana de los glóbulos rojos humanos, pero no tiene un efecto obvio en los glóbulos rojos de cabra.Este PLA2 tiene un efecto de retardo evidente en la velocidad electroforética de los glóbulos rojos en humanos, cabras, conejos y conejillos de Indias.Chen et al.Esta enzima puede inhibir la agregación plaquetaria inducida por ADP, colágeno y ácido araquidónico de sodio.Cuando la concentración de PLA2 es 10/xg/ml~100ug/ml, la agregación plaquetaria se inhibe completamente.Si se usaran plaquetas lavadas como materiales, la PLA2 no podría inhibir la agregación a la concentración de 20 mg/ml.La aspirina es un inhibidor de la ciclooxigenasa, que puede inhibir el efecto de PLA2 en las plaquetas.PLA2 puede inhibir la agregación plaquetaria al hidrolizar el ácido araquidónico para sintetizar tromboxano A2.La conformación de la solución de PLA2 producida por el veneno de Agkistrodon halys Pallas en la provincia de Zhejiang se estudió mediante dicroísmo circular, fluorescencia y absorción UV.Los resultados experimentales mostraron que la conformación de la cadena principal de esta enzima era similar a la del mismo tipo de enzima de otras especies y géneros, la conformación del esqueleto tenía buena resistencia al calor y el cambio estructural en un ambiente ácido era reversible.La combinación de activador Ca2+ y enzima no afecta el entorno de los residuos de triptófano, mientras que el inhibidor Zn2+ hace lo contrario.La forma en que el valor de pH de la solución afecta la actividad enzimática es diferente de los reactivos anteriores.
En el proceso de purificación de PLA2 del veneno de serpiente, un fenómeno obvio es que el veneno de serpiente contiene dos o más picos de elución de PLA2.Este fenómeno se puede explicar de la siguiente manera: ① debido a la existencia de isoenzimas;② Un tipo de PLA2 se polimeriza en una variedad de mezclas de PLA2 con varios pesos moleculares, la mayoría de los cuales están en el rango de 9 000~40 000;③ La combinación de PLA2 y otros componentes del veneno de serpiente complica PLA2;④ Debido a que el enlace amida en PLA2 se hidroliza, la carga cambia.① y ② son comunes, con solo unas pocas excepciones, como PLA2 en veneno de serpiente CrWa/w
Hay dos situaciones: ① y ②.La tercera condición se ha encontrado en PLA2 en el veneno de las siguientes serpientes: Oxyranus scutellatus, Parademansia microlepidota, Bothrops a ^>er, víbora palestina, víbora de arena y serpiente de cascabel terrible km。
El resultado del caso ④ hace que la velocidad de migración de PLA2 cambie durante la electroforesis, pero la composición de aminoácidos no cambia.Los péptidos se pueden romper por hidrólisis, pero generalmente todavía están unidos por enlaces disulfuro.El veneno de la serpiente de cascabel oriental contiene dos formas de PLA2, llamadas tipo a y tipo p PLA2 respectivamente.La diferencia entre estos dos tipos de PLA2 es solo un aminoácido, es decir, la glutamina en una molécula de PLA2 se reemplaza por ácido glutámico en la otra molécula de PLA2.Aunque la razón exacta de esta diferencia no está clara, generalmente se cree que está relacionada con la desaminación de PLA2.Si el PLA2 en el veneno de la víbora palestina se mantiene caliente con el veneno crudo, los grupos finales en sus moléculas de enzima se volverán más que antes.De C PLA2 aislada del veneno de serpiente tiene dos N-terminales diferentes y su peso molecular es 30000. Este fenómeno puede ser causado por el dímero asimétrico de PLA2, que es similar al dímero simétrico formado por PLA2 en el veneno de la serpiente de cascabel de espalda de diamante del este. y la serpiente de cascabel de espalda de diamante occidental.La cobra asiática se compone de muchas subespecies, algunas de las cuales no tienen una clasificación muy definida.Por ejemplo, lo que solía llamarse la subespecie Cobra Outer Caspian ahora se reconoce
Debe atribuirse a la cobra exterior del Mar Caspio.Como hay muchas subespecies y están mezcladas, la composición del veneno de serpiente varía mucho debido a las diferentes fuentes, y el contenido de isoenzimas PLA2 también es alto.Por ejemplo, veneno de cobra.
Se encontraron al menos 9 tipos de isoenzimas PLA2 de r ^ ll especies y 7 tipos de isoenzimas PLA2 en el veneno de la subespecie de cobra Caspian.Durkin et al.(1981) estudiaron el contenido de PLA2 y el número de isoenzimas en diferentes venenos de serpientes, incluidos 18 venenos de cobra, 3 venenos de mamba, 5 venenos de víbora, 16 venenos de serpiente de cascabel y 3 venenos de serpiente marina.En general, la actividad PLA2 del veneno de cobra es alta, con muchas isoenzimas.La actividad PLA2 y las isoenzimas del veneno de víbora son medias.La actividad de PLA2 del veneno de mamba y el veneno de serpiente de cascabel es muy baja o no tiene actividad de PLA2.La actividad PLA2 del veneno de serpiente marina también es baja.
En los últimos años, no se ha informado que PLA2 en el veneno de serpiente exista en forma de dímero activo, como la serpiente de cascabel rombófora oriental (C. el veneno de serpiente contiene PLA2 tipo a y tipo P, ambos compuestos por dos subunidades idénticas , y solo la dimerasa tiene
Actividad.Shen et al.también propusieron que solo el dímero de PLA2 del veneno de serpiente es la forma activa de la enzima.El estudio de la estructura espacial también prueba que la PLA2 de la serpiente de cascabel de espalda de diamante occidental existe en forma de dímero.compuesto piscívoro
Hay dos PLA ^ Ei y E2 diferentes de veneno de serpiente, en los que 仏 existe en forma de dímero, el dímero está activo y su monómero disociado está inactivo.Lu Yinghua et al.(1980) estudiaron más a fondo las propiedades físicas y químicas y la cinética de reacción de E. Jayanthi et al.(1989) aislaron un PLA2 básico (VRVPL-V) del veneno de víbora.El peso molecular del monómero PLA2 es 10000, que tiene efectos letales, anticoagulantes y edematosos.La enzima puede polimerizar polímeros con diferentes pesos moleculares en condiciones de PH 4.8, y el grado de polimerización y el peso molecular de los polímeros aumentan con el aumento de la temperatura.El peso molecular del polímero generado a 96 °C es de 53 100, y la actividad PLA2 de este polímero aumenta en dos
Hora de publicación: 18-nov-2022